禽白血病病毒（ELISA法）检测试剂盒

本试剂盒用于禽白血病病毒 P27 抗原的检测。 本试剂盒是采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（DAS-ELISA）原理来检测禽白血病病毒的P27抗原。检测时，在相应的反应孔中加入阴、阳对照品和待测样品，经温育后，若样品中含有P27抗原，则与酶标板上的抗体结合形成抗原抗体复合物，反之则不能结合。洗涤后，加入的酶标记物与包被板上的抗原抗体复合物发生特异性结合。再次洗涤后加入底物，酶催化底物反应呈现蓝色，颜色深浅与样品中P27抗原的含量成正相关，从而达到快速检测的目的。

操作方法

一：试剂配制

a）0.01 mol/L pH=7.4 PBS 溶液：准确称取氯化钠 8.0 g、氯化钾 0.2 g、磷酸氢二钠1.14 g和磷酸二氢钾0.24 g，加入去离子水溶解并定容至1 L。

b）洗涤工作液：使用前，浓缩的洗涤液应恢复至室温（20-25℃），并摇动，使沉淀溶解（*在37℃恒温培养箱中加热5-10 min），然后用蒸馏水作25 倍稀释（例如：30 mL 的浓缩洗涤液加上 720 mL 蒸馏水）匀，稀释好的洗涤液2-8℃可存放7日。

二：样品处理

蛋清：取全蛋，破碎后，直接取蛋清100μL。 泄殖腔拭子：取棉签于待检鸡只泄殖腔取样，然后放入1 mL PBS溶液（0.01mol/L，pH 值 7.4）中，-20℃以下冰箱中冻融一次，待其恢复至室温后，取 100 μL 进行检测。 疫苗：疫苗稀释液将疫苗溶解，再用0.01 mol/L pH=7.4 PBS稀释10-20倍后，取100μL进行检测。 胎粪：无需稀释，可以直接用于检测，若样品中含有沉淀或杂质，需在2000-3000 r/min，离心 10 min，取 100 μL 上清进行检测。

三：操作步骤

取酶标板（根据样品*，可拆开分次使用），阴性对照、阳性对照和待检样品各取100 μL加至相应微孔中，盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10 s，充分混

匀，室温下（25±2℃）避光反应60 min。

注：阴、阳性对照各设2孔，待检样品设1孔。

甩掉孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液300μL，震荡洗涤4次，每次30s 左右，在干净吸水纸上拍打去除残存洗涤液。 每孔加入100μL酶标记物工作液，盖好盖板膜，室温下（25±2℃）避光反应60 min。 弃去孔中的溶液，洗涤4次，方法同2。 底物A液与底物B液按1:1混合均匀，加入孔中，100 μL/孔，盖上盖板膜，室温下（25±2℃）反应15 min。

注：底物工作液也可提前配制，但配制完后需5 min内使用。

每孔加入终止液100μL，5 min内测定结果。

注：若终止液出现絮状结晶，可37℃加热，待其溶解后使用。

结果判定

在酶标仪上读各孔OD650nm值，计算出阴性对照孔OD均值NC和阳性对照孔OD均值PC。

注：NC值＜0.200且0.500＜PC值≤2.000，试验结果才有效。否则，应进行重复试验。

按照公式计算出S/P值：S/P=（SC-NC）/（PC-NC）。

注：SC为被检样品孔OD值。

如果S/P＜0.17，说明样品中无禽白血病病毒P27蛋白；如果S/P≥0.17，说明样品中有禽白血病病毒P27蛋白。

有效期

贮存方法： 2 - 8oC下贮存。

有效期： 12个月。